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在前文中,我们针对食品中维生素D测定的新标准方法 (GB5009.296-2023) 进行重现 (点击查看☞【应用分享】婴幼儿配方奶粉中维生素ADE的含量测定),采用离线固相萃取+在线二维柱切换的反相液相色谱法,并以婴幼儿配方奶粉样品为例,实现了维生素D的分析测定,同时可以兼顾维生素A和α-维生素E的定量。维生素E是指具有α-生育酚生物活性的所有生育酚和三烯生育酚的总称,主要包括四种生育酚 (α/β/γ/δ- tocopherol) 和四种三烯生育酚(α/β/γ/δ- tocotrienol),其中α-生育酚的活性为100%,按照现行国标 (GB5009.82-2016) 需要将样品中其他所含有的生育酚折算成α-生育酚当量,因此良好的分离是准确定量的前提。本文对方法进行了优化升级,一次进样同时完成对婴幼儿配方乳粉中VA、VD、α/β/γ/δ-VE及α-生育三烯酚(α-TE)的测定。
一
实
验
步
骤
1、
样品制备
注:处理过程应避免紫外光照。
1.1 均质样品
称取粉末试样25 g (精确至0.01 g) 至250 mL干燥玻璃瓶中,加入约200 g温水(约40 °C~45 °C) ,记录加水后的溶液质量 (精确至0.01 g) 。充分混匀溶解,室温避光放置15 min,每隔5 min振摇30 s。
1.2 皂化
称取均质后试样5 g (精确至0.01 g) 至50 mL带螺旋盖的离心管中,加入2 mL抗坏血酸水溶液 (0.2 g/mL) ,6 mL BHT-乙醇溶液 (0.2 g/100 mL) ,涡旋混匀30 s,再加入3 mL氢氧化钾溶液,涡旋混匀后于80 ˚C±2 ˚C条件下避光涡旋振荡30 min,立即冷却,待提取净化。
1.3 提取净化
(1) 活化:SelectCore vADE维生素专用柱200mg/6mL, 依次使用6 mL甲醇、6 mL水活化;
(2) 上样:皂化液在8000 r/min下离心5 min。全部上清液转移至固相萃取柱中,过柱速度控制在每分钟不超过60滴;
(3) 淋洗:用10 mL 5%甲醇水溶液洗涤离心管,涡旋30 s,在8000 r/min下离心5 min,将上清液一并转移到固相萃取柱上样,重复操作2次,弃去淋洗液,真空抽至柱体近干;
(4) 洗脱:用8 mL乙腈-甲醇混合溶液 (3+1) 分三次洗脱,负压抽干,收集洗脱液加水定容至10 mL,溶液用0.45μm Nylon针式过滤器过滤,取续滤液作为待测液;
2、
在线二维液相色谱法测定
2.1 在线二维液相色谱系统
仪器系统: Agilent 1260 Infinity II二维系统;
在线二维柱切换液相色谱系统连接见图1所示
2.2 色谱条件
色谱柱:
第一维色谱柱: vADE-1D-C, 5μm, 4.6×150mm
第二维色谱柱: vADE-2D-A, 3μm, 2.1×100mm
捕集柱: vADE-Trap-A, 5μm, 4.6×10mm
捕集柱卡套: 分体式保护柱卡套
流动相和梯度程序: 略
流速: 第一维泵: 1.0 mL/min;
第二维泵: 0.4 mL/min;
紫外检测波长: 325 nm; 294 nm; 264 nm;
进样量: 100 μL
柱温: 30 ℃
二
实
验
结
果
1、
实验谱图
采用单阀双检测器和双阀单检测器的在线柱切换二维液相系统,混合标准品溶液的分离如图2和图3所示,其中第一维分离谱图中β/γ-VE以及第二维分离谱图中VD2与VD3的分离度均>2.0。
2、
线性关系及定量限考察
取维生素ADE的混合标准品溶液 (VA浓度为2 μg/mL,5种VE的浓度均为10 μg/mL, VD2和VD3浓度均为0.1 μg/mL) 分别进样1、2、5、10和20 μL,以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,考察各待测物的线性相关关系。由表1结果可以看出,所有目标待测物分析物的线性较好 (r2>0.9999) ,其中定量限 (LOQ) 按S/N=10:1计算,VD2和VD3的LOQ分别为0.038 ng和0.037 ng,按固体取样量为0.55 g,定容10 mL,进样体积为100 μL时,方法定量限分别为0.69 μg/100 g和0.67 μg/100 g。
3、
重复性考察
取同一样品溶液,按照确定的色谱条件连续进样5次,计算目标峰保留时间和峰面积的RSD。结果所有目标峰保留时间的RSD<0.1%; VA峰面积RSD为0.59%; α-VE峰面积的RSD为0.31%; δ-VE和γ-VE的峰面积的RSD分别为0.84%和0.65%; 第二维中VD3峰面积的RSD为1.81%,表明本法重复性较好。
4、
加标回收率数据
实验采用皂化液加标来考察目标物在提取净化及仪器分析过程的准确度,将标准品溶液加到皂化溶液中,按照样品提取净化方法制备上机溶液,计算加标回收率。图4为样品与加标样品的叠加谱图,所有目标分析物的回收率在92.3~103.28%,其中VD2和VD3的平均回收率分别为100.86%和103.28%,表明本法准确可靠。
三
实
验
结
论
本文是在前文基础上,对分析条件进行调整,一次进样同时实现对食品中VA、VD、α/β/γ/δ-VE以及α-生育三烯酚的定量。其中β/γ-生育酚和VD2/VD3的分离度均>2.0; 初步方法学考察结果表明本法可满足新国标的测定要求。在样品溶液制备中,与传统的液液萃取方法比较,固相萃取法的操作步骤更少、更加简便,同时也会减少目标物在制备过程中的损失,利于改善方法回收率;纳谱分析推出的SelectCore vADE固相萃取柱是一种新型的单分散聚合物填料的固相萃取柱,相比市场上常见的聚合物产品,滴速更快,回收率更稳定。同时本文所采用在线二维液相方法无需正相色谱的净化步骤,可进一步提升样品分析通量,本法允许大体积进样,以满足VD含量较低的样品基质的分析要求。
相关产品货号信息
常规规格货号 | |
产品描述 | 货号 |
vADE-1D-C, 5μm, 4.6×150mm | S021-050012-04615S |
vADE-2D-A, 3μm, 2.1×100mm | S022-030018-02110S |
vADE Trap-A专用捕集柱 5μm, 4.6×10mm | S023-050012-04601S-B1 |
保护柱卡套 (分体式, 带连接件) | Guard-HPLC-A1 |
SelectCore vADE维生素专用柱 200mg/6mL; 30/pkg | ADE060-060200-1 |
Nylon针式滤器 13mm×0.45μm; 100/pkg, | F-1345NY |
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