背景

乳铁蛋白作为一种具备抗病毒、抑制游离基形成、调节人体铁质转移、促进细胞生长并提高免疫力等重要作用的功能性蛋白，目前已广泛添加在乳制品中以期发挥其功能。此前对于乳铁蛋白含量的检测尚未形成统一的方法，《食品安全国家标准 食品中乳铁蛋白的测定（2021征求意见稿）》的出台，加速了乳铁蛋白检测向标准化方向发展的进程，本文完全按照此标准的操作流程，使用纳谱分析研发的SelectCore Heparin肝素亲和柱进行了柱容量验证及加标回收率测定，使用ChromCore 300Ǻ C4-T色谱柱进行色谱分析，结果均符合国标要求，为乳制品中牛乳铁蛋白的检测提供了全套的整体解决方案。

适用范围

本方法适用于巴氏杀菌乳、调制乳、含乳饮料、乳基婴幼儿配方食品中牛乳铁蛋白含量的测定。

实验步骤

1、试剂的准备

磷酸盐缓冲液Ⅰ：称取7.10 g磷酸氢二钠，58.40 g氯化钠，加适量水溶解，用磷酸调pH至8.0±0.2，加水稀释至1000 mL。

磷酸盐缓冲液Ⅱ：称取28.40 g磷酸氢二钠，加800 mL水溶解，用磷酸调节pH至7.5±0.2，加水稀释至1000 mL。

三氟乙酸溶液（0.1%）：吸取1 mL三氟乙酸，加水稀释至1000 mL，过0.45 μm滤膜。

2、样品的制备

2.1 液态试样（巴氏杀菌乳、调制乳、含乳饮料）

称取5 g（精确至0.01 g）试样于烧杯中，加入适量磷酸盐缓冲液Ⅱ混匀，分次将样品转移至25 mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液Ⅱ定容至刻度，充分混匀后转入离心管，在4 °C下以10000 r/min转速离心12-15 min，取上清液于另一50 mL离心管中，4 °C下以10000 r/min转速离心12-15 min，取样液待净化。

2.2 固态试样（乳基婴幼儿配方食品）

称取5 g（精确至0.01 g）试样于烧杯中，加入温热（温度不超过50 °C）的磷酸盐缓冲液Ⅱ，搅拌使样品溶解，分次将样品转移至50 mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液Ⅱ定容至刻度后，充分混匀后转入离心管，在4 °C下以10000 r/min转速离心12-15 min，取上清液于另一50 mL离心管中，4 °C下以10000 r/min转速离心12-15 min，取样液待净化。

3、固相萃取方法

活化：SelectCore Heparin肝素亲和柱1 mL，加入5.0 mL磷酸盐缓冲液Ⅱ活化；

上样：准确移取步骤2中制备好的样液10.0 mL，控制流速在1 mL/min-3 mL/min，弃去流出液；

淋洗：使用10.0 mL磷酸盐缓冲液Ⅱ淋洗，弃去全部流出液；

洗脱：用5.0 mL磷酸盐缓冲液Ⅰ洗脱，收集全部洗脱液，用磷酸盐缓冲液Ⅰ定容至5.0 mL，过0.22 μm滤膜，供上机检测分析用。

4、柱容量验证

在20.0 mL磷酸盐缓冲液Ⅱ中添加2 mg牛乳铁蛋白标准储备溶液，充分混匀，分别取同一批次3根肝素亲和柱，每根柱的上样量为20.0 mL，经上样，淋洗，洗脱，磷酸盐缓冲液Ⅰ定容至5.00 mL，用高效液相色谱仪测牛乳铁蛋白的含量。

结果判定：牛乳铁蛋白回收率≥80%，为可使用的商品。

5、液相色谱仪器条件

Column：ChromCore 300Ǻ C4-T，5 μm

Dimension：4.6×250 mm

Mobile Phase： A）三氟乙酸溶液（0.1%）

B）乙腈

Gradient：t(min) A B

0 85 15

20 15 85

22 85 15

25 85 15

Flow rate：1.0 mL/min

Temperature：30 °C

Injection：50 μL

Detection：UV 280 nm

实验谱图

图 1 牛乳铁蛋白标准品、巴氏杀菌乳、巴氏杀菌乳加标对比图

柱容量验证回收率

加标回收率

实验结论

由色谱图结果可以看出SelectCore Heparin肝素亲和柱对于牛乳铁蛋白的专属性较高，即使巴氏杀菌乳这种成分比较复杂的样品，目标物周围也无杂质干扰，搭配使用ChromCore 300Ǻ C4-T色谱柱，可以做到准确积分、精确计算。

SelectCore Heparin肝素亲和柱柱容量验证回收率均在90%以上，远大于标准中规定的80%，并且回收率稳定性良好，RSD仅为0.3%，做此验证时，同时对比了其他厂家的肝素亲和柱柱容量验证结果，其中厂家M柱容量验证回收率仅有75%，不符合国标要求。

在使用SelectCore Heparin肝素亲和柱进行固相萃取操作时，也同样选择厂家M肝素亲和柱进行了相同的实验操作，在上样这一步，10 mL的上样液，由于纳谱分析采用单分散聚丙烯酸酯为基球，SelectCore Heparin肝素亲和柱只需5分钟即可全部过柱，并且滴速稳定，而厂家M肝素亲和柱则需要10分钟以上才能完全过柱，滴速会随着上样液体积的增加而变慢。

加标回收率实验也同时对比了厂家M的结果，SelectCore Heparin肝素亲和柱加标回收率为102.21%，符合检测要求，而厂家M加标回收率仅为87%。综合以上实验现象及结果，选择纳谱分析的SelectCore Heparin肝素亲和柱，并搭配使用ChromCore 300Ǻ C4-T色谱柱，可以高效、准确的进行牛乳铁蛋白含量的测定。