1.什么时候需要使用缓冲液？

在反相液相色谱分析中，当被分析物在反相条件下可离解时，就需要缓冲液。在反相条件下可离解的化合物一般都有氨基和羧基，他们的酸碱解离常数pka在1－11之间，选择正确的缓冲液pH值可保证可离解的官能团以一种形式存在，离子形式或中性化合物的形式。如果样品的pH值对柱子有伤害，则缓冲溶液可使其变温和从而减小其危害。

2.如何选择缓冲液pH值

在选择缓冲液pH值之前，应先了解被分析物的酸碱解离常数pka，高于或低于pka两个pH值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰，从pH公式：

pH＝pka+log（[A-]/[A]）（[A-]为已电离浓度/[A]未电离时的浓度）

得知，溶液pH值高于或低于pka两个单位，化合物中99％以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰。

让我们通过一个离子来看如何选择pH值

例如苯甲酸，苯甲酸的pka等于4.2，理论上讲当pH值等于2.2时，99％的苯甲酸以中性化合物存在，pH值等于6.2时，99%的苯甲酸以离子形式存在，所以当缓冲液pH值等于2.2时，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱，从表1 可知，磷酸和柠檬酸缓冲液能用于pH等于2.2。

如果选择不到合适的，样品的pKa与流动相的pH非常接近，那么流动相pH微小的变化，都会引起样品保留时间较大的变动。

当化合物只有氨基时，缓冲体系的选择十分简单，大多数氨基化合物在pH值小于9时都被质子化，所以所有pH值在7或更低的溶液均适合应用，你也许会问水的pH值大约是7，为什么还用缓冲盐，因为缓冲盐有助于增加方法的可靠性，以及色谱峰的尖锐性，pH值的降低有助于氨基化合物保留的减弱，减小化合物与硅胶表面硅羟基的作用，而使峰更尖锐，从表1 可知，任何缓冲液均可应用于氨基化合物的分析，但我们认为pH值等于3的磷酸钾盐最适合用于氨基化合物的分析。

在上面两个例子中，pH＝3的磷酸钾盐都能获得良好的应用，在一般情况下，它是含羧基和氨基化合物分析中最好的缓冲液，并且我们认为在氨基化合物分析中钾盐比钠盐更好。其次，也要考虑检测波长的要求，磷酸可以让用户选择更低的吸收波长，而醋酸（醋酸氨）则能做到质谱友好。

3.为离子对试剂选择缓冲液

为应用离子对试剂的方法选择缓冲液的过程是相似的，离子对试剂例如四丁基铵的盐，十四烷基磺酸钠等，在流动相中可与化合物中可离解的官能团配对，在缓冲液中以离子形式存在的化合物就需要应用离子对试剂。

4.应用缓冲液pH值来调节方法选择性

如前面提到的，氨基化合物的保留随pH的减小而降低，这个特性可以用来调节方法的选择性，如果两个化合物共流出，一个含有氨基，适当改变pH值就可以用来分离这一物质对。由于可离解化合物的选择性依靠pH值，所以变化pH值也可以用来鉴别未知化合物的官能团，如果pH值变小，出峰便快，则化合物中可能存在氨基，当pH变大，化合物出峰很快，或流出在死时间处，化合物可能是一种羧酸，因为羧基离子化后流出大大快于比质子化的中性化合物。

5.缓冲盐使用不当会导致的后果

比如说，色谱柱压升高、柱效下降、保留时间异常等等不良影响：

1）柱压升高；

原因：缓冲盐使用不当导致缓冲盐析出，堵塞塞板和键合相颗粒之间的孔隙，阻碍流动相传质，引起柱压升高。

2）相同化合物的保留时间发生变化；

原因：如果没有冲洗干净就进行进样，色谱柱内含有的盐会使化合物的保留时间发生变化.          

3）柱效下降；

原因：

i）有些缓冲盐会渗入到键合相的深处，损害硅胶基体，导致色谱柱键合相流失，柱床变松，柱效下降；

ii）凝结在键合相表面，使C18碳链难以舒展，对物质的保留能力下降，导致柱效下降。因此用过缓冲盐后需要对色谱柱进行冲洗，水中缓冲盐浓度较大时应特别引起注意。 

6.缓冲盐使用前和使用后的处理

使用前的处理：在使用缓冲盐作流动相之前需要用不含缓冲盐的流动相冲洗色谱柱，直至基线平稳。 原则上，用于冲洗的流动相与分析时所用的流动相含水的比例相同（或含水更多），不同的只是用于冲洗用的流动相中不含缓冲盐。理由：缓冲盐通常易溶于水，难溶于有机溶剂。用含缓冲盐的（特别是做流动相的水为饱和的缓冲盐溶液时）流动相进行分析时，如果分析前色谱柱中用于保存色谱柱的流动相中含水的比例相对较小，不先冲洗掉，接下来做样品的时候所用的流动相中如果有机溶剂含量大，而其比例中所含的水又不足以溶解该缓冲盐时，缓冲盐将会在色谱柱柱体上析出，沉积下来，这将可能导致上述对色谱柱的损害.

使用后的处理：用与分析时含水比例相同的流动相（与分析用流动相唯一的区别是，用于冲洗的流动相不含缓冲盐）进行冲洗约30min，直至基线平稳。如果该色谱柱在接下来很长的一段时间内不使用，要长期保存，则需再加上一步，即用纯的有机溶剂冲洗一遍，直至基线平稳。 

7.缓冲盐使用注意事项！

避免使用盐酸盐，盐酸盐对钢质有腐蚀作用。

缓冲液最好要现配现用，往往缓冲液是良好的菌类培养液，隔天或放置长时间实验时会有很多怪现象发生。

实验后不可用有机溶剂直接过渡，有机溶剂会促使盐类析出，造成液路或色谱柱堵塞，可用95：5的水甲醇冲洗。

使用缓冲液要及时掌握ph范围，做到胸中有数。

清洗液路和柱子时，有温控可加热到30摄氏度易于冲洗。

长时间用缓冲溶液要注意观察接头处有无析出，若有白色盐类析出，可考虑一定周期用10%硝酸冲洗一下液路（拆下柱子，走30ml，再用5倍水冲洗）可以避免液路的堵塞。

选择缓冲液要用可靠的试剂，避免不纯的盐类造成不必要的麻烦。

如果流动相中有机溶剂的比例很高是不能用来冲洗缓冲盐的，是洗不出来的。通常C18柱先用5%~10%的甲醇冲洗，是可以把缓冲盐冲洗出来的，然后用纯的有机溶剂来保护柱子。最好的方法是使用与流动相相同浓度不含盐的流动相进行清洗。但就是速度慢一些。用水是为了快速替换，一般在15分钟以内最好，且用0.8mL/min的流速较好。如果用纯水冲，容易造成键合的碳链的流失，最好用5%~10%甲醇水溶液冲， 可以用纯水代替流动相中的缓冲液，有机相不变。这样冲洗柱子比较稳妥。 

小结

正确使用缓冲盐很有必要，既可以防止缓冲盐析出，也可以达到提高色谱柱使用寿命的目的。我们不妨用一句话来总结它的使用方法：用前要过滤，用后需冲洗。