在前文中，我们针对食品中维生素D测定的新标准方法 (GB5009.296-2023) 进行重现 （点击查看☞【应用分享】婴幼儿配方奶粉中维生素ADE的含量测定），采用离线固相萃取+在线二维柱切换的反相液相色谱法，并以婴幼儿配方奶粉样品为例，实现了维生素D的分析测定，同时可以兼顾维生素A和α-维生素E的定量。维生素E是指具有α-生育酚生物活性的所有生育酚和三烯生育酚的总称，主要包括四种生育酚 (α/β/γ/δ- tocopherol) 和四种三烯生育酚(α/β/γ/δ- tocotrienol)，其中α-生育酚的活性为100%，按照现行国标 (GB5009.82-2016) 需要将样品中其他所含有的生育酚折算成α-生育酚当量，因此良好的分离是准确定量的前提。本文对方法进行了优化升级，一次进样同时完成对婴幼儿配方乳粉中VA、VD、α/β/γ/δ-VE及α-生育三烯酚(α-TE)的测定。

2.1 在线二维液相色谱系统

仪器系统: Agilent 1260 Infinity II二维系统;

在线二维柱切换液相色谱系统连接见图1所示

2.2 色谱条件

色谱柱：

第一维色谱柱: vADE-1D-C, 5μm, 4.6×150mm

第二维色谱柱: vADE-2D-A, 3μm, 2.1×100mm

捕集柱: vADE-Trap-A, 5μm, 4.6×10mm

捕集柱卡套: 分体式保护柱卡套

流动相和梯度程序: 略

流速: 第一维泵: 1.0 mL/min;

         第二维泵: 0.4 mL/min;

紫外检测波长: 325 nm; 294 nm; 264 nm;

进样量: 100 μL

柱温: 30 ℃

取维生素ADE的混合标准品溶液 (VA浓度为2 μg/mL，5种VE的浓度均为10 μg/mL, VD₂和VD₃浓度均为0.1 μg/mL) 分别进样1、2、5、10和20 μL，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，考察各待测物的线性相关关系。由表1结果可以看出，所有目标待测物分析物的线性较好 (r²＞0.9999) ，其中定量限 (LOQ) 按S/N=10:1计算，VD₂和VD₃的LOQ分别为0.038 ng和0.037 ng，按固体取样量为0.55 g，定容10 mL，进样体积为100 μL时，方法定量限分别为0.69 μg/100 g和0.67 μg/100 g。

取同一样品溶液，按照确定的色谱条件连续进样5次，计算目标峰保留时间和峰面积的RSD。结果所有目标峰保留时间的RSD＜0.1%; VA峰面积RSD为0.59%; α-VE峰面积的RSD为0.31%; δ-VE和γ-VE的峰面积的RSD分别为0.84%和0.65%; 第二维中VD₃峰面积的RSD为1.81%，表明本法重复性较好。

实验采用皂化液加标来考察目标物在提取净化及仪器分析过程的准确度，将标准品溶液加到皂化溶液中，按照样品提取净化方法制备上机溶液，计算加标回收率。图4为样品与加标样品的叠加谱图，所有目标分析物的回收率在92.3~103.28%，其中VD₂和VD₃的平均回收率分别为100.86%和103.28%，表明本法准确可靠。