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【应用分享】采用自动在线衍生方法分析人参和红参中游离的氨基酸

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人参为五加科植物人参Panax ginseng C. A. Mey. 的干燥根和根茎,药用和食用价值较高。据记载,人们使用人参养生治病,已有四千多年的历史。人参在我国古代就有神草、王精、地精、土精、血参、人衔等雅号,更有“百草之王”、“补药之王”之美誉。

现代医学临床研究证明,常服人参药膳,可以提高免疫功能,增强抗病能力,延缓机体衰老;可以预防和治疗贫血、糖尿病、冠心病、心律失常、神经衰弱、癌症等多种疾病。

今天,让我们一起来看下人参和红参的分析测定吧!


采用自动在线衍生方法分析

人参和红参中游离的氨基酸



01 背景介绍


氨基酸,是含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物,是生命有机体的重要组成部分。在蛋白质化学、生物化学、制药、食品科学、临床医学等领域的研究中都起着重要的作用。氨基酸液相色谱分析方法包括衍生化方法直接测定法衍生化又分为柱前衍生和柱后衍生:其中柱前衍生反相HPLC法的研究和应用较多,具有简单、快速和高效等优点。

人参经蒸制成红参后,药性由微温转温,补气效果增强。基础化学物质的变化导致上述药性和功效上的转变。据报道,在红参的炮制过程中,主要活性成分人参皂苷发生脱丙二酰化、脱糖基、端基异构化等一系列化学变化过程,氨基酸在蒸制变化过程中扮演重要角色。对蒸制前后氨基酸谱的变化差异进行分析,对蒸制工艺和红参质量控制具有重要意义,本文采用在线自动柱前OPA+FMOC衍生的高效液相色谱法,纳谱分析的ChromCore BR C18 3μm,4.6×100mm色谱柱对红参和人参的氨基酸谱的差异进行分析。

02 检测方法

衍生试剂制备


0.4 mol/L硼酸盐缓冲液(pH10.2):取硼酸24.73 g,加水800 mL溶解,用40%的氢氧化钠溶液调pH到10.2,加水到1000 mL,即得。

邻苯二甲醛溶液(OPA):取邻苯二甲醛80 mg,乙酰半胱氨酸97 mg,加0.4 mol/L的硼酸盐缓冲液7 mL,再加乙腈1.0 mL溶解,即得;

芴代甲氧基酰氯溶液(FMOC):取芴代甲氧基酰氯40 mg,加乙腈8 mL使溶解,即得;

稀释液:取流动相A 100 mL,加磷酸0.4 mL即得。

以上衍生试剂的制备参考《YY/T1695-2020人类辅助生殖医疗器械培养用液中氨基酸检测方法》方法三。

在线衍生方法程序



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色谱条件



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线性关系考察



取浓度为1 nmol/μL的17种氨基酸的混合标准品溶液,加0.1 N的盐酸溶液逐级稀释,制成系列浓度的氨基酸混合标准溶液进样分析,以浓度为横坐标,以峰面积响应为纵坐标,结果17种氨基酸在0.025-1 nmol/μL范围内,线性相关系数r>0.999,表明各目标峰线性相关性较好。分别按照S/N=3:1和10:1计算各氨基酸的最低检出限(LOD)和定量限(LOQ),结果各一级氨基酸的LOD在0.23~0.69 pmol/μL,LOQ在0.77~2.31 pmol/μL;二级氨基酸(脯氨酸)的LOD和LOQ分别为1.82和6.07 pmol/μL。

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精密度测试



取19种氨基酸混合标准品溶液,连续进样6次,结果各目标峰保留时间的RSD<0.18%;各目标峰面积的RSD<1.5%,表明方法精密度良好。

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人参和红参氨基酸谱对比分析


取人参和红参药材粉末1.0 g,精密称定,置锥形瓶中,加水25 mL,先浸泡0.5 h,再超声提取0.5 h。静置后离心,精密移取上清液2 mL,经过预先活化和平衡后的SelectCore HLB 200mg/6mL固相萃取柱,并用2 mL水洗脱,合并流出液和水洗脱液,摇匀后进样分析。

由以上对比谱图可以看出,人参蒸制成红参后,大部分氨基酸成分含量明显下降,尤以R.T=4.92 min的谷氨酰胺(GLN)最为显著。

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方法耐用性考察


有报道称,柱前衍生方法耐用性存在一定挑战。本文对比连续21次进样的系统压力变化,对该方法耐用性进行初步研究,结果由下图可见,系统压力未发生明显变化,目标氨基酸峰形和分离结果均未发生显著变化。

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本文通过实验室自制的衍生化试剂,采用在线自动柱前衍生方法,在ChromCore BR C18色谱柱上,对19种氨基酸进行分析。初步方法学考察结果证明17种氨基酸在25 pmol/μL~1 nmol/μL的范围内,线性相关性良好(r>0.999),一级氨基酸最低检出限(LOD)在0.23-0.69 pmol/μL,二级氨基酸(脯氨酸)LOD为1.82 pmol/μL;方法精密度和初步耐用性测试表现良好。对人参和红参中氨基酸成分进行分析,结果表明蒸制前后,部分氨基酸类成分含量下降明显,说明氨基酸类成分在化学成分转化中扮演重要角色,可以为人参蒸制工艺优化和红参质量评价提供参考。

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相关产品信息


常规规格货号

产品描述

货号

ChromCore BR C18 5μm, 4.6×250mm

A301-050018-04625S

ChromCore BR C18 5μm, 4.6×150mm

A301-050018-04615S

ChromCore BR C18 3μm, 4.6×100mm

A301-030018-04610S

ChromCore BR C18 3μm, 3.0×50mm

A301-030018-03005S

SelectCore HLB 200mg/6mL, 30/pkg

HLB060-060200-1

保护柱及柱芯

产品描述

货号

ChromCore BR C18 5μm, 4.6×10mm

A301-050018-04601S

ChromCore BR C18 3μm, 4.6×10mm

A301-030018-04601S

保护柱卡套(分体式,带连接件)

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