背景

近期部分中药检测企业反馈黄连、黄柏含大量色素和生物碱对GCMSMS色谱柱污染较为严重极易造成目标物线性不好、回收率低并且重现性差，常规的固相萃取法一、固相萃取法二、固相萃取法三都不能很好的净化，色谱柱前端污染较为严重，容易导致GCMSMS久效磷和甲基硫环磷丢峰。纳谱分析根据植物色素成分特点，近期又针对以上含色素和生物碱样品分析存在的问题，优化了固相2和固相3产品对于色素的吸附能力。相比常规固相萃取方式，优化后的固相萃取柱可以吸附更多生物碱类成分、鞣质类成分和色素成分，从而降低了样品中色素对色谱柱的污染和基质效应。今天，我们来看看黄连、黄柏项目的前处理效果吧。

适用范围

 本方法参考中国药典2020版2341第五法中的固相萃取法2和固相萃取法3，适用于含有生物碱基质干扰大和色素较多的中药材农残检测。

实验步骤

1 对照品溶液的制备

1.1 混合对照品配制

   精密量取禁用农药混合1mL，置20mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，备用；

1 .2 气相色谱-串联质谱法分析用内标溶液的制备

取磷酸三苯酯对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并制成每1mL含1.0mg的溶液，即得。精密量取适量，加乙腈制成每1mL含0.1μg的溶液。

1.3 空白基质溶液的制备

取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。

1.4 基质混合对照溶液的制备

分别精密量取空白基质溶液1.0mL(6份），置氮吹仪上，40°C 水浴浓缩至约0.6mL，分别加入混合对照品溶液l0μL、20 μL、50 μL、100μL、150μL、200μL，加乙腈稀释至lmL，涡旋混匀，即得。

2  供试品溶液的制备

2.1 提取

精密称取5g样品（3号筛），加氯化钠1g，加入50mL乙腈，匀浆处理2分钟，离心后分取上清液，残渣再加50mL乙腈，匀浆处理1分钟，离心后，合并两次提取上清液，减压浓缩至3~5mL，加乙腈定容至10mL，摇匀，待净化。

3   净化

GCMSMS样品：

SPE柱：SelectCore GCB/NH2-A 固相萃取柱 500mg/500mg/6mL

净化：量取乙腈：甲苯（3:1）10ml过SelectCore GCB/NH2-A 固相萃取柱 500mg/500mg/6mL活化，活化液弃去，精密移取直接提取法制备的样品液2ml置萃取小柱上，待样品液全部过萃取小柱后，加乙腈：甲苯（3:1）20ml洗脱，收集全部洗脱液，40℃以下减压回收至适量转移至已校准过的10ml具刻度离心管内，再用适量乙腈充分洗涤减压回收瓶，洗液并入同一离心管内，氮吹至2ml，混匀，即得。

GC/MS/MS测定：精密量取过固相萃取柱后减压回收定溶后的溶液1mL，氮吹至0.4ml加入混合对照溶液，乙腈定溶至1ml，再加入0.3 mL磷酸三苯酯溶液，混匀，过PTFE膜，上机分析。

注意事项：固相萃取柱SelectCore GCB/NH2-A 上层填料粒径较大，运输过程中可能会与上筛板产生一点间隙而导致滴速不均匀，使用前用玻璃棒或者注射器推杆压实就可以了。另外该固相萃取柱中含有的填料会对磺隆类化合物和久效磷产生较大吸附，故LCMSMS样品分析建议用固相2的方法来处理。

LCMSMS样品：

SPE柱：SelectCore HLB-B 固相萃取柱 200mg/6ml

净化：量取直接提取法制备的供试品液3ml，过SelectCore HLB-B中药农残专用固相萃取柱，收集全部净化液，混匀，即得。

LC/MS/MS测定：精密量取过固相萃取柱后溶液1mL氮吹至0.4ml加入混合对照品液，乙腈定溶至1ml，再加入0.3 mL水，混匀，过PTFE膜，上机分析。

4   气相色谱-串联质谱法（岛津 GC-MS -TQ8040 NX）

色谱条件

色谱柱：SHIMADZU SH-Rxi-17Sil MS，30m×0.25mm，0.25μm;

进样口温度：250℃；

升温程序：初始温度为60℃，保持1min；以10℃/min升温至160℃；再以2℃/min升温至230℃，最后以15℃/min升温至300℃，保持6min；

载气：高纯氦气（纯度>99.999%）；

进样方式：不分流进样；

恒压模式：146kPa；

进样量：1μL。

质谱条件

电离方式：电子轰击电离源（EI）；

电离能量：70Ev；

接口温度：250℃；

离子源温度：250℃；

监测方式：多反应检测模式（MRM）；

溶剂延迟：10.0min。

5   高效液相色谱-串联质谱法（岛津 LC-MS 8045）

色谱条件

色谱柱：ChromCore C18-MS Pesticides中药农残专用柱(2.1 ×100 mm，2.6 μm)

流动相：

A：0.1%甲酸水溶液（含有5mmol/L甲酸铵）

B：乙腈-0.1%甲酸水溶液（含有5mmol/L甲酸铵）=95:5

流速: 0.3 mL/min

柱温: 40 ℃

进样量: 2 µL

梯度：

质谱条件

离子源: 电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI）正离子扫描

监测方式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）

离子源接口电压：4.5kV

雾化气：氮气3.0L/min

加热气：干燥空气10.0L/min

DL温度：250℃

加热模块温度：400℃

接口温度：300℃

干燥气：N₂ 10 L/min

表1  黄连中33种农药残留的的测定添加回收结果（%）

6  处理后溶液的颜色比对

7   黄连、黄柏普通净化方式与GCB/NH₂-A柱的CGMSMS数据分析TIC图

8 实验讨论

通过以上实验数据比对，可以看出，SelectCore GCB/NH₂-A 中药农残专用固相萃取柱，针对黄连、黄柏中大量色素和生物碱类成分去除效果良好，且溶液颜色较浅，减少污染气相色谱柱、衬管和离子源的风险，还极大的消除了由于基质效应带来的硫丹、滴滴滴、六六六等农残成分的回收率偏低、目标物线性不好，回收率重现性差的问题，并且有客户反馈色谱柱前端污染而导致久效磷和甲基硫环磷丢峰的问题也得到了解决。SelectCore HLB-B中药农残专用固相萃取柱，对黄连、黄柏中色素成分祛除效果良好，减轻了由于基质中干扰物导致的LCMSMS上样品中目标化合物响应低的问题，极大地减小了对离子源的污染，且目标化合物回收率高而稳定。两款固相萃取柱为黄连和黄柏的农药残留实验数据的稳定性和可靠性提供了良好的帮助。