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上周，“分不开怎么办”栏目收到了一位王同学的咨询，她在人参皂苷类化合物分析方面遇到了一些困难：

王同学的诉求是寻找一个合适的HPLC分析方法（包括色谱柱和流动相），能够实现样品中所有人参皂苷的良好分离（ Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1）。

收到问题后，我们的“大师兄”团队立即联系了王同学，针对她的诉求提出了一些建议。

王同学的这个案例很有代表性，因此今天我们就以这个案例为例，和大家分享一下在做HPLC分析方法开发时的思路和心得。

通常来说，建立合适的HPLC分析方法，你需要：

针对今天的案例，我们一条条看：

01

分离目标和方法要求

首先，我们明确这个实验的目的是通过合适的HPLC方法实现人参皂苷化合物 Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1的分离。

02

解析目标分析物

建立合适的人参皂苷HPLC分析方法，需要进行全方位的考虑，其中化合物结构是至关重要的点。

人参皂苷（ Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf和Rg1等 ）是人参的主要成分，都具有相似的基本结构：含有由30个碳原子排列成四个环的甾烷类固醇核。

根据人参皂苷化合物的这些特点，我们确定了建立HPLC方法的要点：

04

调整色谱柱和实验条件

2020版中国药典人参的含量测定项规定的色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

但是中国药典方法中并没有明确色谱柱的细节，包括色谱柱规格、固定相粒径和孔径，而这些往往会影响分离效果。

我们先按照该方法，使用相同规格的不同孔径ChromCore 120 C18（120 Å）和ChromCore C18 （180 Å）对人参皂苷Rg1和Re进行分析，得到如下结果：

在药典人参方法下，人参皂苷Rg1和Re在ChromCore 120 C18（120 Å）和ChromCore C18 （180 Å）上都能获得良好的峰型，在ChromCore C18 （180 Å）获得更好的分离度（R>2.0），满足药典要求。

ChromCore 120 C18（120 Å）和ChromCore C18 （180 Å）两款色谱柱采用相同的硅胶基质和键合工艺，主要差别在于孔径。

另外，2020版中国药典西洋参的含量测定项规定的色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

我们再按照该方法，使用相同规格的不同孔径ChromCore C18（180 Å）和ChromCore 300 C18 （300 Å）对人参皂苷Rg1和Re进行分析（两种人参皂苷在ChromCore 120 C18上共流出，谱图未放）：

在药典西洋参方法下，人参皂苷Rg1和Re在ChromCore C18（180 Å）未获得基线分离，而在ChromCore 300 C18 （300 Å）获得更好的分离度，完全满足药典要求。

西洋参方法中梯度斜率高于人参方法（梯度更陡），因此人参方法适用的ChromCore C18（180 Å）在西洋参方法下，无法实现Rg1和Re的基线分离。

05

得到稳定靠谱实验方法

经过上面实验的对比，最后我们选用ChromCore 300 C18 （300 Å），在中国药典人参方法下，对7种人参皂苷进行分析：

由以上谱图可知，7种人参皂苷在ChromCore 300 C18 （300 Å）上都能获得良好的峰型和分离，完全满足HPLC定性和定量要求。

希望今天这个案例的梳理，能够对你的HPLC分析方法开发工作有所启发和帮助。

如果你在分析实验中也遇到了方法开发、或者仪器软硬件方面的问题，欢迎来咨询，我们会尽力帮你答疑解惑。

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