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服务与支持

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【应用分享】复方丹参片中5个三萜皂苷类成分的含量测定(中国药典)
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固相萃取净化—HPLC法




快速测定复方丹参片中

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5个三萜皂苷类成分的含量

复方丹参片是我国临床上应用较为广泛的国家基本药物,针对冠心病、心绞痛、门脉高血压症、缺血性脑血管疾病、消化性溃疡、冠状动脉硬化等病症具有良好的治疗效果。该药品由丹参、三七和冰片3味药组成,自1981年面世后,目前拥有生产批文的企业达671家,市场容量巨大[1]1985年版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)首次收载,历版药典通过对该品种的多次修订,质量和检测标准得以不断提高。然而近些年各省药监局抽检公布的信息显示,市场上流通的复方丹参片存在着质量参差不齐,不同厂家、甚至同一厂家不同批次生产的复方丹参片有效成分含量存在较大差异[2],特别是贵重原料三七,曾有生产厂家在制剂生产过程中为降低成本偷工减料而导致三七项下的含量测定不符合要求[4-6]2020年版《中国药典》中规定了复方丹参片三七项下4个三萜皂苷类成分的高效液相色谱含量测定方法[7],但在实际操作过程中,复方丹参片样品经甲醇提取后,三萜皂苷类各组分的分离易受到复方制剂其他组分的干扰,引起测定数据的不准确[2,8-9]

查阅文献报道,中成药复方制剂中三萜皂苷的含量测定一直是个难点,图1为5个三萜皂苷的结构式,从结构可见,三萜皂苷类成分极性跨度较大、紫外响应较低(普遍用紫外波长203 nm),这就造成干扰峰众多而引起定量不准确。目前测定三萜皂苷含量的方法有高效液相色谱-紫外检测、高效液相色谱-蒸发光散射检测和高效液相色谱-质谱检测,前处理方法主要是通过乙醚或者三氯甲烷脱脂后用水饱和正丁醇液液萃取,或者通过固相萃取如大孔吸附树脂或者硅胶键合C18来去除杂质和皂苷的富集。孙彩华等[10]采用70%乙醇水提取后,用水饱和正丁醇萃取5次净化,高效液相色谱-紫外法测定生脉胶囊中人参皂苷Rg1和Re的含量;王健等[11]采用甲醇提取后,三氯甲烷除脂弃去,用水饱和正丁醇萃取6次、氨试液洗涤2次、正丁醇饱和的水再洗涤2次后,高效液相色谱-紫外法测定参芪消渴颗粒中人参皂苷Rg1和Re的含量;郭建博等[12]利用中性氧化铝和D101大孔吸附树脂混合填料的固相萃取柱净化,超高效液相-二极管阵列检测器测定保健食品中6个人参皂苷类成分含量;高钧等[13]采用硅胶键合C18固相萃取柱净化后,高效液相色谱-紫外法测定三参舒心片中人参皂苷Rb1含量。以上分析方法,从文献谱图可以看出,由于基质较为复杂、三萜皂苷含量较低、紫外末端波长干扰较大,为准确定量而采用液质联用法测定复方制剂中三萜皂苷成分的含量[14-15],但液质联用法存在不宜普及,运行成本高,操作难度大等问题。

固相萃取技术是一种近几年来迅速发展起来的样品前处理新技术,相比传统的液液萃取、固相萃取具有操作更加方便、除杂效果更好、目标组分回收率更高等优点。目前固相萃取材料主要包括键合型硅胶和有机聚合物,键合硅胶的分辨率较好,但pH耐受性较弱,并且残存的硅羟基易于脱去质子形成负离子而强烈地吸附阳离子,从而引起易离解化合物和碱性化合物的回收率降低[16]聚合物的化学稳定性较好,但分辨率较硅胶弱可能导致杂质与目标物质共洗脱,这就造成硅胶键合和聚合物2种类型固相萃取填料的应用范围受到一定的限制,近年来以聚合物包覆硅胶键合型填料是解决上述问题的有效途径之一[17]相比于传统的硅胶键合填料和聚合物填料,该包覆型材料避免了强极性和碱性物质的非特异吸附,同时利用硅胶骨架的优点,提高填料的分离性能。本文采用聚苯乙烯包覆硅胶键合C18的新型固相萃取填料,对复方丹参片进行了前处理,高效液相色谱-紫外检测,方法准确、可靠,可解决复方丹参片中三萜皂苷成分测定时,干扰组分引起数据不稳定的问题。

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·图1 5个三萜皂苷的结构式·

Abbreviations: GLC (D-葡萄糖)

                         Xyl (D-木糖)

                         Rha (L-鼠李糖)


三七皂苷R1(notoginsenoside R1

人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1)

人参皂苷Re (ginsenoside Re) 

人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb1

人参皂苷Rd(ginsenoside Rd)

CHAPTER 01

仪器与试药

Shimadzu LC-2040C高效液相色谱仪、Milli-Q超纯水制备系统、Sartorius BT25S十万分之一电子天平、BL10-300A数控超声仪;

对照品三七皂苷R1、人参皂苷Rd购于成都瑞芬思生物科技有限公司;

人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1购于成都曼思特生物科技有限公司;

所有对照品质量分数均≥99%;

甲醇、乙腈(色谱纯,上海星可高纯溶剂有限公司);

磷酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);

ChromCore C18 5μm, 4.6×250mm、ChromCore 120 C18 5μm, 4.6×250mmChromCore 300 C18 5μm, 4.6×250mm、ChromCore 300 C18 3μm, 4.6×100mm、ChromCore 300 C18 3μm, 3.0×100mm、SelectCore C18 500mg/6mL、SelectCore HLB 200mg/6mL、SelectCore PSL 200mg/6mL、SelectCore HR-C18 500mg/6mL均来自纳谱分析技术(苏州)有限公司;

复方丹参片均购自苏州药房,亳州某药厂、云南某药厂、广州某药厂,3个厂家所生产的复方丹参片作为质量研究的样品。阴性样品为自制。




CHAPTER 02

方法与结果

2.1 / 色谱条件

色谱柱:ChromCore 300 C18 3μm,3.0×100mm

流动相:A:乙腈;

               B:0.1%磷酸水;

流速:    0.8 mL/min;

柱温:    30 ℃;

进样量:2 µL;

检测波长:203 nm

梯度洗脱条件:t(min)        %A       %B

                            0              19         81
                            7              19         81
                            20            40         60
                            21            80         20
                            23            80         20
                            24            19         81        

2.2 / 对照品溶液的制备

2.2.1 对照品溶液

取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd对照品适量,精密称定,加70%甲醇水制成每1 mL含人参皂苷Rg1、Rb1和Rd各0.2 mg,三七皂苷R1及人参皂苷Re各0.05 mg的混合溶液。


2.2.2 供试品未净化溶液

按照《中国药典》2020年版含量测定项下,取复方丹参片10片,除去包衣,研细,精密称取1.0 g,置100 mL具塞三角瓶中,加入70%甲醇水50 mL,超声提取30 min,放冷后再称定重量,用70%甲醇水补足减失的重量,摇匀后取上清液经0.45 μm有机微孔滤膜滤过,取续滤液,作为供试品未净化溶液。


2.2.3 供试品过固相萃取柱溶液

供试品过固相萃取柱溶液  取复方丹参片10片,除去包衣,研细,精密称取1.0 g,置具塞三角瓶中,加入70%甲醇水50 mL,超声提取30 min,放冷后再称定重量,用70%甲醇水补足减失的重量,摇匀后用滤纸滤过,精密移取续滤液10 mL水浴蒸干,残渣加10 mL水溶解后上固相萃取柱(SelectCore HR-C18 500mg/6mL,使用前分别用甲醇5 mL和水5 mL活化),弃去流出液,依次使用10 mL水和10 mL 40%甲醇水溶液淋洗,弃去淋洗液,最后用6 mL甲醇洗脱,收集洗脱液,用甲醇定容至10 mL,摇匀,经0.45 μm有机微孔滤膜滤过,取续滤液,作为供试品经固相萃取柱净化溶液。


2.2.4 缺三七阴性供试品溶液

参照《中国药典》复方丹参片的制剂工艺,选择丹参、冰片和适量辅料,制成不含三七的阴性样品,按照“2.2.3”方法制备缺三七阴性供试品溶液。

2.3 / 系统适用性试验

分别精密吸取“2.2”项的混合对照品溶液、供试品未净化溶液、供试品经固相萃取柱净化溶液、缺三七阴性供试品溶液各2 μL,进样分析,结果见图2。相比供试品未净化溶液,供试品经固相萃取柱净化溶液的色谱图基线平稳,峰形尖锐,5个组分与相邻色谱峰的分离度均大于1.5,缺三七阴性供试品溶液在5个成分相对应保留时间处均未检出。

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·图2  复方丹参片净化前后的对比色谱图·

1.三七皂苷R(notoginsenoside R1)   

2.人参皂苷Rg(ginsenoside Rg1)  

3.人参皂苷Re (ginsenoside Re)   

4.人参皂苷Rb(ginsenoside Rb1)   

5.人参皂苷Rd (ginsenoside Rd)


a.供试品未净化溶液(Fufang Danshen solution without SPE) 

b.供试品过固相萃取柱溶液(Fufang Danshen solution with SPE) 

c.缺三七阴性供试品溶液(Negative Fufang Danshen solution with SPE) 

d.混合对照品溶液(Standard solution)

2.4 / 方法学考察

所建方法可使干扰组分大幅减少,三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd 5个三萜皂苷类成分能够有效分离,分析时间缩短为20 min,并分别在5.0~100.0、20.0~400.0、5.0~100.0、20.0~400.0、20.0~400.0 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数(r≥0.9999)。方法的重现性良好(RSD≤1.0%),三七皂苷R1,人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd的平均回收率为95.8%、96.3%、98.2%、94.4%和97.8%,RSD分别为1.4%、0.8%、1.2%、0.9%和1.1%,回收率良好,满足定量分析要求。

2.5 / 样品测定

分别取3家生产商生产的复方丹参片,各三批分别按照“2.2.2”和“2.2.3”项方法制备供试品未净化溶液和固相萃取柱净化溶液溶液,外标法分别计算5个皂苷成分的含量,测定结果见表1,图谱如图3。根据2020年版《中国药典》中对复方丹参片中总皂苷的含量≥6 mg/片的要求[7],本实验中测得的3个厂家的复方丹参片都符合药典含量要求。

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·图3 不同厂家复方丹参片《中国药典》方法处理和固相萃取处理后的色谱图对比·

1.三七皂苷R1(notoginsenoside R1)

2.人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1

3.人参皂苷Re(ginsenoside Re) 

4.人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb1

5.人参皂苷Rd(ginsenoside Rd) 


a.云南某药厂样品SPE净化(sample from Yunnan with SPE)

b.云南某药厂未净化样品(sample from Yunnan without SPE)   

c.广州某药厂SPE净化样品(sample from Guangzhou with SPE)   

d.广州某药厂未净化样品(sample from Guangzhou without SPE)   

e.亳州某药厂SPE净化样品(sample from Bozhou with SPE)   

f.亳州某药厂未净化样品(sample from Bozhou without SPE)   

g.混合对照品(Standard solution)


通过对3个不同厂家的复方丹参片2种方法谱图和含量数据的对比发现,《中国药典》方法测定三七皂苷R1和人参皂苷Re的时候,有明显的杂质干扰,这就引起2个组分的峰面积积分受到影响,如三七皂苷R1的积分面积偏小,而人参皂苷Re的积分面积偏大。而在用我们开发的固相萃取前处理后的样品溶液,测定基线平整,5个组分的干扰较小。

表1

2种方法测定不同厂家的复方丹参片含量数据对比

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CHAPTER 03

讨 论

3.1 / 色谱条件的选择

本实验前期比较了ChromCore C18 5μm, 4.6×250mm、ChromCore 120 C18 5μm, 4.6×250mmChromCore 300 C18 5μm, 4.6×250mm三种不同孔径填料的色谱柱对分离效果的影响。结果显示,在相同的色谱条件下,ChromCore C18和ChromCore 120 C18对人参皂苷Rg1和Re不能有效分离,而ChromCore 300 C18对5个三萜皂苷的分离度都较为良好,另外分别考察了ChromCore 300 C18 3μm, 4.6×100mm和ChromCore 300 C18 3μm, 3.0×100mm,后者的溶剂消耗和分析时间都较为理想,因此实验最终选择ChromCore 300 C18 3μm, 3.0×100mm色谱柱进行分离。实验对梯度体系进行了优化,最终流速0.8 mL/min,分析时间在20 min内,系统压力在25 MPa以下,相比《中国药典》方法流速1.3 mL/min,90 min梯度洗脱,本实验的溶剂消耗减少了86%,分析时间减少了78%,不仅减少了溶剂排放,加快了分析效率,并且还可以在常规高效液相色谱仪上使用。

3.2 / 固相萃取材料的选择

目前针对三萜皂苷类成分的固相萃取方法,绝大多数都是以大孔吸附树脂柱或者硅胶键合C18的反相疏水保留模式为主,而正是由于5个三萜类皂苷的极性跨度较大,对固相萃取填料要求较高,不仅仅需要保证三萜皂苷成分的回收率,还需要将干扰组分尽可能去除。本研究选择50 μm UniSil单分散硅胶为载体,用聚苯乙烯基团团聚于硅胶微球表面,形成聚苯乙烯包覆层,然后该聚苯乙烯包覆的硅胶再与十八烷基结合,成为1款新型填料,以此更好的保留皂苷类物质。作为效果对比,我们选择了常规硅胶键合C18填料、聚乙烯吡咯烷酮填料(HLB)、聚苯乙烯填料(PSL)和我们自制的聚苯乙烯包覆硅胶键合的C18填料(HR-C18)在三萜皂苷类物质回收率和净化能力分别进行了对比。从图4和表3的不同固相萃取材料色谱对比图和回收率数据来看,硅胶键合C18填料对于复方丹参片中的中等极性成分保留较好,而亲水性成分在洗涤项下洗出较多,造成三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Re的回收率接近于0;聚苯乙烯PSL填料对于复方制剂保留了更多的成分,但是由于该款填料亲脂性较强同时亲水性相对较弱,因此对于亲水性较大的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Re保留较弱,回收率还是较低;聚乙烯吡咯烷酮HLB填料由于带有苯环的亲脂基团和带有吡咯烷酮的亲水基团,对于5个三萜皂苷成分的回收率得到提高,但是对于人参皂苷Re周围的干扰成分净化效果弱,引起人参皂苷Re含量计算的不准确,这些可能会造成不同批次不同厂家复方丹参片的分析误差。HR-C18是我们研制开发的1款聚苯乙烯包覆的硅胶键合C18填料,不仅仅有硅胶填料的高分辨性,也有聚合物填料的高保留性,在保留5个皂苷成分的同时,净化能力较强,较好的解决了分析干扰的问题。

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·图4  复方丹参片在不同固相萃取材料处理后色谱对比图·


1. 三七皂苷R1(notoginsenoside R1)   

2. 人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1)   

3. 人参皂苷Re(ginsenoside Re)   

4. 人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb1)    

5. 人参皂苷Rd(ginsenoside Rd)


a. HLB

b. C18

c. HR-C18

d. PSL   

e. Standard solution

表2

5个成分在不同固相萃取柱的回收率(%)

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3.3 / 固相萃取洗脱条件的选择

选择将“2.2.1”对照品混标溶液加水稀释,通过HR-C18固相萃取柱500 mg/6mL,分别用水、20%甲醇水、40%甲醇水、60%甲醇水、80%甲醇水和100%甲醇洗脱3 mL,每1.5 mL收集洗脱液进行测定回收率,5个三萜皂苷在HR-C18小柱上的洗脱曲线如图5所示,三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re在60%甲醇水就开始流出,80%甲醇水洗完;而人参皂苷Rb1和Rd在80%甲醇水开始流出,在100%甲醇洗完。因此为了除去更多的干扰成分和保证5个三萜皂苷组分的回收率,我们最终选择用40%甲醇水淋洗10 mL弃去,后用100%甲醇洗脱6 mL的洗脱方法。

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·图5 5个三萜皂苷成分在HR-C18固相萃取小柱的洗脱曲线·


CHAPTER 04

结 论


本实验首次采用1种新型的聚苯乙烯包覆硅胶键合C18固相萃取法对复方丹参片进行了样品前处理后快速液相色谱法分析测定,具有较为明显的净化效果,5个三萜皂苷组分峰型良好,周围无干扰峰,并且目标组分回收率高,分析时间快、溶剂消耗少,方法具有操作简单、快速、准确的优点,可以满足复方丹参片中三萜皂苷成分的快速定量控制要求,可为含有三七和人参等五加科植物的中成药的质量控制提供方法依据。